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    這些細胞培養的常識,你掌握了嗎?

    1.如何選擇培養基?

    培養某一類型細胞沒有固定的培養條件。在 MEM 中培養的細胞,很可能在 DMEM 或 M199 中同樣很容易生長??傊?,首選 MEM 做粘附細胞培養、RPMI-1640 做懸浮細胞培養,各種目的無血清培養的首選是 AIM V 培養基(SFM)。

    2.為什么要熱滅活血清?

    加熱可以滅活補體系統。激活的補體參與溶解細胞事件,刺激平滑肌收縮,細胞和血小板釋放組胺,激活淋巴細胞和巨噬細胞。在進行免疫學研究、培養 ES 細胞、昆蟲細胞和平滑肌細胞時,推薦使用熱滅活血清。

    3.L-谷氨酰胺在細胞培養中重要嗎?它在溶液中不穩定嗎?

    L-谷氨酰胺在細胞培養時是重要的。脫掉氨基后,L-谷氨酰胺可作為培養細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經過一段時間后會降解,但是確切的降解率一直沒有最終確定。L-谷氨酰胺的降解導致氨的形成,而氨對于一些細胞具有毒性。

    4.GlutaMAX-I 是什么?培養細胞如何利用 GlutaMAX-I?這個二肽有多穩定?

    GlutaMAX-I 二肽是 L-谷氨酰胺的衍生物,將其不穩定的 α-氨基用 L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽,釋放 L-谷氨酰胺供利用。GlutaMAX-I 二肽非常穩定,即使在 121 磅滅菌 20 分鐘,GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解,如果在相同條件下,L-谷氨酰胺幾乎完全降解。

    5.為什么培養基中可以省去加酚紅?

    酚紅在培養基中被用來作為 PH 值的指示劑:中性時為紅色,酸性時為黃色,堿性時為紫色。研究表明,酚紅可以模擬固醇類激素的作用(特別是雌激素)。為避免固醇類反應,培養細胞,尤其是哺乳類細胞時,用不加酚紅的培養基。由于酚紅干擾檢測,一些研究人員在做流式細胞檢測時,不使用加有酚紅的培養基。

    6.如何用臺盼蘭計數活細胞?

    用無血清培養基把細胞懸液稀釋到 200-2000 個/毫升,在 0.1 毫升的細胞中加入 0.1 毫升的 0.4%的臺盼蘭溶液。輕輕混勻,數分鐘后,用血球計數板計數細胞?;罴毎懦馀_盼蘭,因而染成藍色的細胞是死細胞。

    7.如何消除組織培養的污染?

    當重要的培養污染時,研究者可能試圖消除或控制污染。首先,確定污染物是細菌、真菌、支原體或酵母,把污染細胞與其它細胞系隔離開,用實驗室消毒劑消毒培養器皿和超凈臺,檢查 HEPA 過濾器。高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性,因而,做劑量反應實驗確定抗生素和抗霉菌素產生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素 B 和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養污染的實驗步驟。

    1)在無抗生素的培養基中消化、計數和稀釋細胞,稀釋到常規細胞傳代的濃度。

    2)分散細胞懸液到多孔培養板中,或幾個小培養瓶中。在一個濃度梯度范圍內,把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如,兩性霉素 B 推薦下列濃度,0.25,0.50,1.0,2.0,4.0,8.0 mg/ml。

    3)每天觀測細胞毒性指標,如脫落,出現空泡,匯合度下降和變圓。

    4)確定抗生素毒性水平后,使用低于毒性濃度 2-3 倍濃度的抗生素的培養液培養細胞 2-3 代。

    5)在無抗生素的培養基中培養細胞一代。

    6)重復步驟 4。

    7)在無抗生素的培養基中培養 4-6 代,確定污染是否以已被消除。

    8.培養基中丙酮酸鈉的作用是什么?

    丙酮酸鈉可以作為細胞培養中的替代碳源。盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源,但是,如果沒有葡萄糖的話,細胞也可以代謝丙酮酸鈉。

    9.Hank’s 平衡鹽溶液(HBS)要在空氣中使用,不需要 CO2 培養箱。原因是什么?

    Hank’s 平衡鹽溶液(HBS)和 Earle’s 平衡鹽溶液(EBS)有什么本質的功能差別?HBS 和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平,碳酸氫鈉的含量在 Eagles (2.2g/L)中比在 Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的 CO2 平衡,以維持溶液的PH 值。Eagles 液在空氣水平的 CO2 中,溶液會變堿,Hanks 液在 CO2 培養箱中會變酸。如果希望在 CO2 培養箱中保存組織,需要用 Eagles 液。如果僅僅是清洗將要在細胞培養基中儲存的組織,用 Hanks 液就可以了。

    10.Qualified 和 Certified 胎牛血清有什么差別?

    Certified 胎牛血清包括了 Qualified 胎牛血清執行的所有的標準檢驗程序,而且除了這些標準檢測,Certified 胎牛血清還有如下一些附加的檢測:

    End-Point Determination of Endotoxin Content

    噬菌體檢驗

    生物化學檢測

    激素的檢測

    血紅蛋白檢測

    Sf9 細胞生長促進及方法學檢測

    11.二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎?使用胰蛋白酶時加入 EDTA 的目的是什么?

    二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA 用來螯合游離的鎂離子和鈣離子,以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細胞前,用 EDTA 清洗細胞,以消除來自培養基中所有的二價離子。

    12.制備 lipid-DNA 的方法會影響轉染效率嗎?

    是的。對于 LIPOFECTAMlNE Reagent,稀釋試劑在 100μl OPTI-MEM 中,稀釋 DNA 在 100μl OPTI-MEM 中?;旌蟽煞N溶液在室溫下孵育 15 分鐘。對于 LIPOFECTIN Reagent,在加入 DNA 溶液前允許稀釋的試劑和培養基孵育至少 30 分鐘可以增加 3 倍的效率。確保復合物在沒有血清的情況下形成。孵育 15 分鐘后,在復合物中加入含有血清的培養基(800μl)。(注意以上是 35mm 培養皿使用體積)。對于 LIPOFECTAMlNE Plus Reagent DNA 應該在與脂質體混合之前首先與 Plus Reagent混合。LIPOFECTAMlNE 2000 的操作步驟允許在一個很小的體積下混合 DNA 和脂質體,接下來可以不需要換培養基的情況下直接加入。

    13.我使用 SF900 Ⅱ時,細胞生長良好,但是為什么我的蛋白產物不如使用 Graces 液和 10%胎牛血清時效果好?

    如果目的蛋白是一個后期蛋白,它將與蛋白酶一起表達,這些蛋白酶將會作用于目的蛋白。在加有血清的培養基中,這些蛋白酶將作用到血清中的蛋白,從而使目的蛋白產品保持完好。在無血清配方中,蛋白酶作用的唯一底物是你的目的蛋白。為了避免這一問題,加入一些蛋白酶抑制劑或加入少量的血清(少于 1%),讓血清給蛋白酶提供作用底物。

    14.如何檢測內毒素(熱源)水平?

    LAL(Limulus Amebocyte Lysate)試驗是可用的最敏感和特異的檢測細菌內毒素的方法。Levin 和 Bang 發現細菌可引起鱟(Limulus polyphemus)血管內的凝集作用。內毒素啟動一個細胞內酶原系統(絲氨酸蛋白酶級聯反應系統),通過修飾凝集素,產生一種透明的膠,LAL 中的凝固蛋白,從而,形成不可溶的基質。LAL試劑緩沖的鱟(血細胞)裂解物。

    胎牛血清的內毒素檢測是在 Grand Island,按照手冊上 Gel-clot 方法進行的。在對血清產品進行內毒素檢測前,用無熱源的水 1:10 稀釋樣品。稀釋樣品沸水育 5分鐘,以消除抑制劑。(通常,血液中的內毒素結合成份的出現會抑制凝膠過程,使內毒素不能與 LAL 反應。樣品預先熱處理可以消除這種抑制作用。)

    15.我可以使用固體形式的 Murashige Skog 培養基嗎?

    如果使用固體形式的培養基,需要加入瓊脂。瓊脂加入前要先滅菌。應該避免 MS 培養基的直接滅菌,應該高壓滅菌瓊脂溶液,然后把融化的瓊脂溶液加入到 MS 培養基中。

    16. 20℃下配制的緩沖液,在較高或較低的溫度下 PH 值會改變嗎?

    對于普通使用的緩沖液,PH 值隨溫度變化而變化。下表列出溫度改變 10℃時,PH 值的變化情況

    例如 20℃下配制 PH7.4 Tris 緩沖液,40℃時 PH 值為 7.4-(2x0.310)=6.78

    17. 室溫下(25℃)配制的 Tris-HCl 溶液,在 37℃使用時 PH 值是多少?

    緩沖液的 PH 值隨溫度變化而變化。下表列出了 50mM Tris-HC 溶液在 4℃,25℃,37℃時,不同的 PH 值。

    4°C 25°C 37°C

    8.1 7.5 7.2

    8.2 7.6 7.3

    8.3 7.7 7.4

    8.4 7.8 7.5

    8.5 7.9 7.6

    8.6 8.0 7.7

    8.7 8.1 7.8

    8.8 8.2 7.9

    8.9 8.3 8.0

    9.0 8.4 8.1

    9.1 8.5 8.2

    9.2 8.6 8.3

    9.3 8.7 8.4

    9.4 8.8 8.5

    18. 昆蟲細胞培養的最適 PH 值和滲透壓是多少?

    生長培養基的 PH 值對細胞的增值和病毒或重組蛋白的生產均會產生影響。對于大部分鱗翅類昆蟲細胞系,在 PH 值 6.0-6.4 范圍的大部分應用效果良好。培養鱗翅類昆蟲細胞系時,培養基的最適滲透壓是 345-380mOsm/kg.。為保證可靠和持久的細胞培養方式,減少技術問題,保持 PH 值和滲透壓在以上所列的范圍之內。

    19. High Five 細胞有任何其它名稱嗎?

    High Five 細胞也被稱為 Trichoplasia ni 5B1-4 和 BTI-TN-5B1-4。

    20.在 High Five 無血清培養基中去污劑的濃度是多少?

    High Five 無血清培養基中去污劑的濃度:0.025 g/L Tween-80,1.0 g/L Pluronic Poly-all。

    21.High Five 細胞用多大的密度凍存?

    3.0x10E6 cells/ml

    22.在我的果蠅培養基中發現形成白色沉淀,加熱后溶解。它是什么?對我的細胞有害嗎?

    可能是谷氨酰胺沉淀,但是更可能是 L-酪氨酸沉淀。培養基中谷氨酰胺的濃度比典型的 2mM 高 6 倍。酪氨酸的濃度比在 RPMI 1640 中高 25 倍,而且比谷氨酰胺更

    加難以溶解。沉淀也可能是不止一種成分的復合物。它可能是由于貯存在局部溫度較低的地方引起。只要沉淀在培養條件下可以溶解,對實驗不會有不利的影響。

    23.如何從 T25 瓶中轉移 sf9 細胞?能用胰蛋白酶消化嗎?

    我們強力推薦使用脫落細胞的方法,因為這項技術破壞性最小,生活力最高。通過使用巴氏德吸液管,讓細胞上培養基流動。作為一種選擇你也可以輕輕拍打培養瓶。

    只有在絕對必要的情況下,才使用胰酶消化細胞。

    胰酶消化一個 T25 瓶的 sf9 細胞:

    1)去除培養基。

    2) 用 2ml 1xPBS(足以覆蓋細胞表面)洗滌細胞,去除 PBS.

    3) 加入 2ml 1x 胰酶 EDTA(恰好覆蓋細胞表面)。

    4) 37 ℃孵育 5 到 10 分鐘。在儀器下檢測看到 5 分鐘后它們正在向上移動。

    5) 向細胞中加入 2ml 細胞培養液,移入錐形管,用 2ml 培養液洗瓶壁,移入同一錐形管中。(培養基中的 FBS 終止了胰酶的活性。)

    6) 離心(1100rpm)沉淀細胞。去除培養基。

    7) 用新的培養基重新懸浮細胞。傳代。

    24.在 Sf9, Sf21, 和 high Five 細胞懸浮培養時,肝素的使用量是多少?

    為了防止懸浮培養細胞聚集的形成,使用肝素濃度為 10 單位/毫升細胞懸液。

    25.如何評估 ES 細胞合格的胎牛血清?

    使用 D3 ES 細胞。這是一個對于胎牛血清中生長促進、生長抑制和分化因子非常敏感的細胞系。相關生長效率分析:當 ES 細胞以非常低的密度傳入包含 10%胎牛血清的生長培養基中,檢測開始和支持 ES 細胞克隆的能力。

    細胞毒分析:

    當以非常低的密度傳入包含 30%胎牛血清的生長培養基中,檢測 ES 細胞和 feeder 細胞的生長能力。

    相關形態學和分化分析:

    檢測胎牛血清支持未分化 ES 細胞克隆的能力。通過堿性磷酸酶活性評估分化程度。未分化的 ES 細胞小顏色深紅粉紅,分化的細胞較大,豐滿,顏色較淺。

    所有的分析在沒有 ESGRO 的情況下進行的,培養基中出現 ESGRO 會掩蓋由胎牛血清所導致的問題。(ESGRO 或 LIF 經常用來保持 ES 細胞處于未分化狀態。)

    經過培養發現,大約 8 批中有 1 批可以用來培養 ES 細胞。

    26.在重新凍存 sf9 細胞前,它可以傳多少代?隨著傳代的次數的增加,它的感染能力會降低嗎?

    通常情況當細胞經過 30 次傳代后,應該返回凍存。無論什么時候記數時,都應該檢查細胞活力。如果超過 95%的細胞保持有活力和在大約 30 小時左右加倍,細胞仍然可以使用。如果活力和加倍時間下降,它們的感染力將不在是有效的。


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