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    還怕細胞量不夠嗎?細胞傳代操作無保留傳授!

    細胞傳代培養是細胞培養常規保種方法之一,也是幾乎所有細胞生物學實驗的基礎。當細胞隨著培養時間的延長和細胞不斷分裂,細胞之間相互接觸而發生接觸性抑制,生長速度減慢甚至停止,且也會因營養物不足和代謝物積累而不利于細胞生長或發生中毒。因此,細胞在培養瓶中長滿后就需要將其稀釋,分種成多瓶,細胞才能繼續生長。這一過程就叫傳代。

     

    細胞傳代作為一種常規的實驗操作,不但可以擴大細胞培養的數量,同時也可以避免細胞因進入平臺期乃至衰亡期而大量死亡的窘境。所以為了讓細胞保持在對數生長期,維持細胞旺盛的分裂能力,這時候就需要進行細胞傳代。

     

    細胞傳代要在嚴格的無菌條件下進行,并且根據不同細胞采取不同的方法:

    ? 貼壁生長的細胞用消化法傳代;

    ? 部分貼壁生長但貼壁不牢固的細胞可以采用直接吹打傳代;

    ? 懸浮生長的細胞可以采用直接吹打或離心沉淀后再分離傳代,或直接用自然沉淀法吸除上清后,再吹打傳代。

     

    上次講了細胞復蘇操作,今天來講講細胞傳代的操作(適用于貼壁細胞的傳代培養)!

    細胞復蘇流程圖

    細胞傳代流程圖

     

    01

    細胞傳代前準備

    ? 實驗開始前,將15mL離心管、移液管、槍頭等實驗需要用到的耗材放入無菌超凈工作臺,紫外線照射30min。

    ? 將完全培養基、PBS、胰酶預熱至37℃。

    ? 倒置顯微鏡下觀察細胞形態和生長密度,當細胞生長密度達到80%~90%匯合度即可進行傳代。

     

    02

    胰蛋白酶/EDTA消化

    ? 棄去舊培養基,PBS洗去殘留的舊培養基,重復洗兩次。

     

    注意:

    貼壁加入到培養皿的邊緣,不能直接對著細胞加入PBS,容易把細胞都吹起來。這一步的目的是為了去掉殘余的培養基,殘余的培養基會含有血清和一些離子等,不利于接下來的消化。

    棄去PBS,加入0.25%Trypsin-0.04%EDTA(T25培養瓶加入約1.5mL,T75培養瓶加入約3mL),迅速鋪勻,保證充分接觸細胞表面(消化時間視具體細胞而定)。

    ? 顯微鏡下觀察消化情況,約70%~80%細胞收縮變圓后,輕拍培養容器外壁,使細胞脫離培養表面。立即加入2倍胰酶量的完全培養基輕搖培養容器,使培養基和胰酶迅速混勻,終止消化。

    ? 使用吸管或移液管輕輕吹打細胞表面,吹打培養容器底面數次,盡可能將細胞都吹打下來。

     

    注意:

    吹打動作不可劇烈,避免產生大量氣泡,否則可能損傷和損失細胞。

    ? 取所有細胞懸液放入無菌15mL離心管內,250×g,室溫離心4min。

     

    03

    細胞培養

    ? 離心后去除上清。加入適量完全培養基,輕柔吹打細胞沉淀,充分吹散、混勻,計數。將細胞按(2.5~4)×104個活細胞/cm2接種至適宜的培養容器內。

    ? 搖勻細胞,放入37℃、5%CO2、飽和濕度的CO2培養箱中。

    ? 傳代次日,觀察細胞狀態。若發現較多漂浮細胞,應予以換液。

    ? 待細胞生長至80%~90%匯合度,即需傳代或凍存。

     

    注意事項

    胰酶濃度

    推薦胰酶使用濃度為0.25%-0.04%EDTA,使用之前需預熱至37℃且pH值應維持在7.2左右。切忌消化過度(包括胰酶濃度過高、消化時間過長等),否則會導致細胞死亡、分化、狀態變差,分化能力丟失等現象。細胞消化過程中需要在顯微鏡下觀察細胞的消化程度,當看到大部分細胞變圓不貼壁,拍打培養瓶兩側會有大量細胞脫落,此時應立即終止消化;若細胞仍有大部分貼壁,可適當延長消化時間以避免消化不徹底的情況出現。

     

    細胞的差異

    不同種類的干細胞差異很大,特別是與腫瘤細胞株的差異更大,很多經驗不可以直接使用,消化時需要仔細摸索最佳的時間。

     

    接種密度

    干細胞傳代過程中接種密度至關重要,如果太低會導致細胞增殖緩慢,甚至導致細胞老化,而細胞的老化是不可逆轉的。一般細胞接種密度為20000個活細胞/cm2即5×105個活細胞/T25,不同的干細胞接種密度會稍有差異,比如hMSC,我們推薦的傳代接種比例為1:2。

     

    吹打細胞動作要輕柔

    吹打動作不可劇烈,避免產生大量氣泡,否則可能損傷和損失細胞。


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    Shanghai Chuan Qiu Biotechnology Co.,Ltd.
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