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    血小板裂解液作為胎牛血清的替代品

    背景

    間充質干細胞/基質細胞(MSCs)被定義為自我更新的多能祖細胞,能夠分化成中胚層來源的其他細胞類型,如脂肪細胞,骨細胞和軟骨細胞。

    從培養基中分離的MSC顯示出一致的表型特征,例如粘附于塑料表面,細胞表面分子CD105,CD73CD90的陽性,以及造血標記物和HLA-DR的陰性。以及此共享標志物分布,不同亞群的MSC可以特征的表型和功能異質性 。

    MSCs 通過體外抑制T細胞增殖  ,通過直接的細胞間接觸和通過產生包括一氧化氮在內的可溶性因子發揮有效的免疫抑制和抗炎活性 。 ,肝細胞生長因子(HGF)和轉化生長因子(TGF-β1 ,以及吲哚胺2,3-雙加氧酶(IDO 。

    使用胎牛血清FBS)和MSC的離體擴增其他動物衍生的已氣餒由監管機構,以減少發送朊病毒和其他動物傳染病的危險,并且避免在所述異種免疫反應主辦。然而,由于缺乏FBS制劑標準化導致細胞培養性能 不一致性和FBS生產已經到來,因為動物福利問題最初提出血小板裂解物(PL)作為動物血清的替代物,用于由Doucet等人體外擴增MSC。 包含在PL的生物活性分子和生長因子支持的MSC從骨髓(BM 導出的膨脹,臍帶血(UCB ,和脂肪組織(AT ,與FBS相比顯示出有利的結果。此外,間充質干擴大了與PL-富集介質已被用于治療患有激素難治性急性移植物抗宿主?。?/span>GVHD)造血干細胞移植后患者和患有幾種骨科疾病的患者,主要是中度至重度的膝關節骨性關節炎 。

    因此,使用PL在無異種條件下分離和擴增MSC可以代表FBS的有價值的替代方案。

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    評論

    在細胞培養物中生產和使用動物血清

    歷史上用于培養細胞的動物血清 是具有不同生長促進和抑制活性的生物分子的復合組合。它在培養基中的主要功能是提供刺激細胞增殖的營養因子,并提供轉運蛋白,礦物質,微量元素,脂質,附著因子,以及維持pH或抑制蛋白酶和其他有毒分子所需的穩定和解毒元素  。FBS是在屠宰場中從健康水壩胎兒中獲得的,用于人類消費。FBS優于成年動物的血清,因為其γ-球蛋白含量降低,從而降低了可能的抗體與細胞培養物相互作用的風險。

    在這種背景下,2013年出現了一起欺詐案 ,當時發現2003年至2011年期間生產的一些FBS受到標簽不合格的影響。

    在過去10年中已經進行了識別動物血清替代品大量的努力,其中包括無血清培養基從裂解或人血小板的活化獲得 和副產物。然而,替代培養基的使用仍然在很大程度上尚未開發,并且動物血清仍然是例如疫苗生產中的必需成分。

    人類PL制劑

    從血小板釋放生長因子可以通過從血小板單采或從血沉棕黃層獲得的富含血小板血漿(PRP)的反復凍融循環來實現(圖  1)。簡言之,將PRP袋在-80℃下冷凍過夜,然后在+ 37℃下解凍這個循環重復一到三次。在匯集和一個或多個離心/過濾步驟以去除細胞碎片后,PL已準備好添加到生長培養基中(綜述于 )。不同實驗室采用的制備程序可能因新鮮或過期血小板的使用,凍融循環次數,病原體減少(PR)和過濾步驟而異,導致釋放的生長因子的濃度和完整性發生變化??赡芘c血小板顆粒破壞的功效有關。

    圖片3.jpg 

     

    PL和血小板釋放制備的程序

    Hara等人先前已經描述了產生PL的超聲處理。單獨或與凍融循環相結合 。超聲波是頻率≥20kHz的聲音。它們的作用是基于液體中超聲波的傳遞,它們產生熱和非熱效應。對于后者,超聲波作用于溶解的氣體,其中液體的壓縮之后是稀薄的。因此,微氣泡與所施加的超聲波能量的每個周期擴大,直到它們到達一個不穩定的大小,然后將它們碰撞和/或在名為空化 過程猛烈崩潰。

    我們之前已經描述過使用20kHz頻率的超聲波從新鮮PRP產生PL。在定量血小板衍生的生長因子-ABPDGF-AB)后估計裂解的效率。超聲處理30分鐘后,74%的PDGF-AB從培養基中的血小板顆粒中釋放出來。

    血小板因子可以通過生理刺激如凝血酶,膠原,二磷酸腺苷,腎上腺素,和凝血酶受體激活肽 也可被釋放,氯化鈣2  ,或三?丁基磷酸酯和Triton X-45為了獲得所謂的血小板釋放。用于釋放血小板因子的方法是導致最終產品的批次間差異的重要變量,但很少有研究涉及該主題。

    已經觀察到,用凝血酶(血小板釋放)激活血小板后獲得的PL和通過血小板冷凍/融化獲得的PL刺激了BM衍生的MSC的不同增殖速率。特別地,血小板釋放顯著加速BM-MSC增殖,以產生在前兩次傳代中臨床相關的細胞數量。MSC質量和功能包括細胞表面標志物表達,脂肪形成和成骨分化以及免疫抑制作用在來自所有培養條件的MSC中是相似的。

    我們在含有通過CaCl 2活化產生的10%血小板釋放的培養基中擴增BM-MSC ,觀察到第8代細胞的累積群體倍增時間約為通過反復冷凍獲得的含有10PL的培養基中擴增的相同細胞的兩倍。解凍周期。我們沒有觀察到在兩種情況下擴增的細胞的表型和免疫調節特性的任何差異。此外,先前的研究報道,反復凍融循環對生長因子的含量 而負面影響。需要進一步研究以研究不同PL制造技術對細胞擴增,分化和免疫調節的可能影響。

    使用過期的血小板單位進行PL生產

    由于在臨床中對血小板單元的需求而供體有限,因此使用新鮮的血小板單元來產生PL引起了關注。過期的血小板單位可能代表另一種來源,因為有證據表明可以使用從過期單位獲得的血小板而不會影響最終產品的質量。

    在一個擁有380萬居民的意大利地區,2014年生產了大約100,000個來自單一捐贈者的血沉棕黃層單位。其中約60%在有效期后被丟棄??紤]到50ml的平均血沉棕黃層體積,僅使用過期的血沉棕黃層單位可以生產約3000LPL。

    血小板衍生因子

    血小板含有生物活性分子和生長因子,通過物理或生理方法在血小板破壞后從α-顆粒中釋放出來。其中包括凝血因子,粘附分子,蛋白酶抑制劑和蛋白多糖,堿性成纖維細胞衍生生長因子(bFGF),表皮生長因子(EGF),HGF,血管內皮生長因子(VEGF),胰島素樣生長因子-1IGF-1),TGF-β1,可溶性CD40L,血管細胞粘附分子-1,細胞間粘附分子-1,PDGF-AA,PDGF-AB,PDGF-BB,趨化因子(CC)配體5和趨化因子(CXC)配體1 / 2/3。所有這些分子都會影響細胞增殖和功能 并且與FBS相比可以促進增殖 。

    這些因素在細胞擴增中的作用僅有部分了解。中和實驗表明,一些血小板因子對于MSC增殖是必需的,因此PDGF-BBbFGF的抑制分別使MSC增殖減少約20%和50 。

    Kinzebach等人進行了廣泛的功能和差異蛋白質組學分析以鑒定影響MSC的體外擴增的血小板衍生因子。 使用MALDI-TOF和蛋白質印跡以及Horn等人。  使用人細胞因子抗體陣列。在Horn等人的研究中,8PL的趨化因子譜與增殖活性相關,顯示出增加PDGF-AB濃度的顯著正效應。

    血小板因子的含量可能因臍帶血(CB)或外周血(PB)產生的血小板釋放而不同  。使用廣泛的蛋白質組學陣列,作者發現幾種強烈支持胎兒組織形成的激素如催乳素,黃體酮和甲胎蛋白僅存在于從CB獲得的血小板釋放中。此外,在CB釋放中,作者確定了已知促進血管生成的更高濃度的因子,例如VEGF。相反,蛋白質組學分析顯示從PB獲得的血小板釋放包含更多的促炎因子,例如趨化因子CC4,金屬蛋白酶3和趨化因子(CC基序)配體5。

    使用高通量蛋白質組陣列分析,Crespo-Diaz等人進行了PL的準確蛋白質組學解剖 。在PL的細胞外信號分子中,FGF / EGF,TGF-β/骨形態發生蛋白(BMP)和VEGF / PDGF被高度代表。

    富含PL的培養基中MSC的分離和離體擴增

    在他們的開創性研究中,Doucet等人。在FCS或補充PL的培養基中擴增的MSCs,證明后者促進MSC擴增,從而減少了達到匯合所需的時間,同時與FCS培養物相比增加了成纖維細胞集落形成單位(CFU-F)的大小。 。在PL存在下培養的MSC保持其三線性分化潛能和它們的免疫抑制活性。

    Schallmoser等。 提供證據表明PL可以取代FBS用于MSCs的臨床規模擴增。PL在支持MSC擴增方面比FBS更有效,并且盡管形態上不同,但MSC在免疫表型,分化潛能和小鼠致瘤性缺乏方面沒有顯著差異。

    Capelli等人。  證明PL允許從BM吸出物的診斷樣品開始臨床級產生MSC,或在BM輸注結束時使用袋和過濾器殘余物。與FBS相比,PL獲得了顯著更快的擴增。在形態學,分化潛能,表面標志物和免疫學性質方面沒有觀察到差異。同一作者證明,臍帶來源的MSCs也可以在PL中擴展 。

    MS中免疫調節作用的改變在PL中擴大

    PL可能改變某些相關MSC表面分子的表達,削弱它們對T細胞增殖的抑制能力,同種異體抗原和NK細胞增殖和細胞毒性 。還報道了靜息和干擾素-γ-引發的BM-MSCAT-MSC的免疫抑制性能降低,以及與FBS相比IDO-1的表達水平減弱。

    相反,我們的研究組表明,與在FBS或人血小板血漿(hPPP)中擴增的AT-MSC相比,PL中擴增的AT-MSC對淋巴細胞增殖有更強的抑制作用。此外,Flemming等人。 證明,與其FCS培養的對應物相比,PL中擴增的BM-MSC對淋巴細胞增殖具有相當的抑制作用。Bernardo等人進一步證實了這些數據。

    PL生物安全

    Crespo-Diaz等人提出了MSC離體擴增期間細胞轉化的風險。通過評估在PLFBS中長期培養后BM-MSC的染色體穩定性。值得注意的是,在第12代沒有觀察到克隆核型異常。

    我們小組研究了PL增加的MSC增殖是否會誘導染色體不穩定。令人欣慰的是,正如我們小組 所示,暴露于濃度增加的PL的中國倉鼠卵巢K1細胞系中的微核形成沒有變化。通過內源性β-半乳糖苷酶表達評估在含有FBSPL的培養基中培養長達16代的MSC的衰老。將用FBS培養不同數量傳代的MSC轉換至PL條件以評估PL“拯救”MSC增殖能力的能力。有趣的是,老化和衰老的MSCPL培養顯示細胞再生,這反映在倍增時間減少和細胞尺寸減小。此時,這一觀察背后的機制尚未闡明 - 但可以推測,特定生長因子如EGF或更可能是PL中生長因子的組合可能介導其對老化MSC培養物的有益作用。

    Schallmoser等人研究了FBSPL培養后的基因表達變化 。令人驚訝的是,所有BM-MSC制劑在長期培養后顯示出顯著的基因表達變化特別是,參與細胞分化凋亡和細胞死亡的基因被上調,而參與有絲分裂和增殖的基因被下調,表明長期擴增誘導了BM-MSC中相似的基因表達變化,而與分離和擴增條件無關。

    羅曼等人。分析了供體年齡對PL功能的影響,觀察到源自年輕供體的PLMSC增殖顯著更高,并且來自較老供體的PL增加了衰老相關β-半乳糖苷酶的活性。

    病原體減少

    減少病原體的策略

    除病毒污染外,血小板單元特別容易受到靜脈穿刺部位或供體菌血癥的外來病原體的細菌污染。PR因此可以在制造過程中,以降低細菌和病毒載量 實施 。目前的PR技術包括溶劑洗滌劑處理,亞甲藍/光,核黃素/紫外光或amotosalen /紫外光(Intercept TM)。

    雖然PR可能可以降低已知和未知的傳染病傳播的風險,最近的研究對PR對轉錄血小板的作用和蛋白質組的報告強調需要進一步的研究,以評估PR中的作用PL的制造過程。

    Shih等。比較FBS與失活的PL擴增AT-MSC,得出結論,治療沒有改變分化能力或細胞免疫表型。

    基于核酸通過使用補骨脂素加上紫外線光活化過程的破壞血小板捐贈的病原體滅活系統已被開發,用滅活的捐款產生的PL是能夠維持BM-MSC擴增和免疫調節。

    還通過評估MSC的免疫調節,免疫表型,增殖和三線性分化來測試從用PR系統(Intercept TM)處理和未處理的過期單位開始制備的PL的功能性。有趣的是,結論是由過期和病原體減少的血小板制備的PL支持MSC分化和免疫抑制比未治療的PL更好 。

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    結論

    已經產生了大量關于制備方式和PL表征的實驗室數據,表明與在富含FBS的培養基中擴增的MSC相比,PL中擴增的MSC生長更快。如果將PL的使用升級為制造其他細胞治療劑或生物制藥產品,則對PL的需求可能會急劇增加。在未來的情景中,應該解決幾個問題。

    供應

    每年FBS可用性估計約為500,000-600,000 L /年,其中約1/3是適合于良好生產規范(GMP)生產。近年來,血清的年需求量下降主要是因為疫苗的生產已轉向使用無血清微生物或哺乳動物細胞培養物 。與此同時,由于疫苗行業需求減少以及為牛肉和奶制品飼養的大量牛只,全球動物血清的產量和可用性都在下降  ,從而限制了該產品的可訪問性。牛血清的要求和產量的下降與細胞治療和再生醫學產品的需求增加同時發生。因此,全球獻血的可用性需要涵蓋臨床需求,細胞制造和研究  。在這種情況下,即使缺乏商定的質量標準,過期的血小板單位也可能成為PL的主要來源。主要由學術界和越來越多的血庫推動的PL生產,表征和測試過程很難與現在提供GMP生產的PL的工業制造商競爭。

    處理

    已經提出了幾種從血小板釋放生長因子的方法,導致不同的釋放效率和PL效力。應對所用方法的標準化達成共識。

    發布標準

    即使一些研究表明某些特定細胞因子在PL中具有重要作用,但迄今為止尚未找到共識。一個問題是相同的細胞因子含量是否對不同細胞類型是關鍵的。從這個意義上說,PL定義的基本步驟之一是指定發布標準。

    PL或釋放生產方法似乎在產品的最終組成中起作用,可能調節從血小板顆粒釋放的因子的數量和質量。PL中細胞因子和生長因子的最終濃度也可能與合并的血小板單位數和最終血小板濃度有關。

    由于PL含有血漿和血小板蛋白質組,因此制劑中人免疫球蛋白GIgG)的濃度可在812 mg / ml之間變化  ,也可能與最終產品中的生產過程和血漿濃度有關。 。為了降低由細胞制劑中高濃度的同種異體IgG引起的患者副作用的風險,應該定義PL制劑中的IgG濃度。

    在發布產品之前,將參考MSC制備擴展到至少與FBS相當的預定水平的能力可能是評估PL質量的措施。應保持在PL或釋放中擴增的MSC的免疫調節特性,并且開發用于評估該功能的標準測定將是有利的。釋放標準還應包括內毒素含量以及病毒和細菌安全性。

    總之,我們已經確定了定義PL的實質性需求以及了解介導PL對細胞生長的有益作用的機制。迫切需要科學社團,最終用戶,血液中心和工業界的合作努力來提高我們的知識。

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    縮略語

    AT,脂肪組織; bFGF,堿性成纖維細胞衍生生長因子; BM,骨髓; BMP,骨形態發生蛋白; CB,臍帶血; CFU-F,成纖維細胞集落形成單位; EGF,表皮生長因子; FBS,胎牛血清; GMP,良好生產規范; GVHD,移植物抗宿主病; HGF,肝細胞生長因子; hPPP,人血小板血漿; IDO,吲哚胺2,3-雙加氧酶; IGF-1,胰島素樣生長因子-1; IgG,人免疫球蛋白G; MSC,間充質干/基質細胞; PB,外周血; PDGF,血小板衍生生長因子; PL,血小板裂解液; PR,病原體減少; PRP,富含血小板的血漿轉化生長因子,轉化生長因子; UCB,臍帶血; VEGF,血管內皮生長因子

     


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