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    小鼠單核細胞趨化蛋白1ELISA試劑盒Mouse MCP-1 ELISA KIT
    貨號:HM-14
    價格:¥2800.00/1760.00.00
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    小鼠單核細胞趨化蛋白1定量分析酶聯免疫檢測試劑盒

     

    本試劑盒僅供科研使用。用于體外定量檢測小鼠血清、血漿或細胞培養上清液中的MCP-1濃度。使用前請仔細閱讀說明書并檢查試劑組分是否完整,。如有產品包裝破損或質量投拆,請在收到貨一個月之內聯系我們。

     

    MCP-1簡介:

    單核細胞趨化蛋白1(MCP-1/CCL2),也被稱為單核細胞趨化與激活因子(MCAF),單核細胞和T細胞及NK細胞的激活因子,屬于趨化因子家族CC亞族一個成員。小鼠MCP-1 cDNA編碼99個氨基酸組成的前體蛋白,成熟蛋白只有76個氨基酸,是前體蛋白被酶切掉23個氨基酸疏水性信號肽形成的。

    MCP-1被認為在與單核細胞滲透相關的許多疾病有關,包括動脈粥樣硬化、類風濕性關節炎和過敏反應等。幾例體外動物模型實驗表明MCP-1在炎癥反應的過程中扮演著重要的角色。MCP-1也被證明在包括胃癌、食管上皮磷癌、惡性膠質瘤、卵巢癌、胰腺癌、膀胱癌和乳腺癌的調控中起作用。

    體內分泌MCP-1的細胞有:單核細胞、肥大細胞、T細胞、成骨細胞、成纖維細胞、內皮細胞、表皮細胞、小膠質細胞、星形膠質細胞及平滑肌細胞等。

     

    檢測原理:

    本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法檢測樣本中MCP-1的濃度。MCP-1捕獲抗體已預包被于酶標板上,當加入標本或參考品時,其中的MCP-1會與捕獲抗體結合,其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。當加入生物素化的抗小鼠MCP-1抗體后,抗小鼠MCP-1抗體與MCP-1接合,形成夾心的免疫復合物,其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。隨后加入辣根過氧化物酶標記的親合素。生物素與親合素特異性結合,親合素連接的酶就會與夾心的免疫復合物連接起來;其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。最后加入顯色劑,若樣本中存在MCP-1將會形成免疫復合物,辣根過氧化物酶會催化無色的顯色劑氧化成藍色物質,在加入終止液后呈黃色。通過酶標儀檢測,讀其450nm處的OD值,MCP-1濃度與OD450值之間呈正比,通過參考品繪制標準曲線,對照未知樣本中OD值,即可算出標本中MCP-1 濃度。

     

    小鼠MCP-1定量分析酶聯免疫檢測試劑盒組成:

    組分

    規格(96T/48T)

    小鼠MCP-1預包被板

    12條/6

    樣本分析緩沖液

    5ml/3ml

    標準品稀釋液

    10ml/5ml

    小鼠MCP-1標準品

    2支/1支(凍干)*

    小鼠MCP-1生物素化抗體

    10ml/5ml

    HRP連接的酶結合物

    10ml/5ml

    濃縮洗滌液 20×

    30ml/15ml

    TMB底物

    10ml/5ml

    終止液

    5ml/3ml

    封板膠紙

    3/2

    說明書

    1

    標本收集:

    1.標本的收集請按下列流程進行操作;

    A.細胞上清標本離心去除懸浮物后即可;

    B.血清標本應是自然凝固后,取上清,避免在冰箱中凝固血液;

    C.血漿標本,推薦用EDTA的方法收集;

    D.若待測樣本不能及時檢測,標本收集后請分裝,凍存于-20℃,避免反復凍融。

    2.血清標本不應添加任何防腐劑或抗凝劑;

    3.標本應清澈透明,檢測前樣本中如有懸浮物應通過離心去除

    4.請勿使用溶血,高血脂或污染的標本檢測,否則結果將不準確。

    注:小鼠血清或血漿樣本請用樣本分析緩沖液做倍比稀釋后再檢測。

     

    注意事項:

    1.試劑盒請保存在28℃。

    2.濃縮洗滌液因在低溫下可能有結晶,請水浴加熱使結晶完全溶解后再配制工作液。

    3.標準品復溶加樣后,剩余部分請丟棄。

    4.底物請勿接觸氧化劑和金屬。

    5.加樣時,請及時更換槍頭,避免交叉污染。

    6.嚴禁混用不同批號的試劑盒組份。

    7.充分混勻對保證反應結果的準性很重要,在加液后請輕輕叩擊邊緣以保證混勻。

    8.室溫反應,請嚴格控制在25~28℃。

    9.洗滌過程是至關重要的,洗滌不充分會使精確度下降并導致結果誤差較大。

    10.試驗中標準品和樣本檢測時建議作雙復孔。

    11.加樣過程中避免氣泡的產生。

    12.血清和血漿標本的檢測時,檢測抗體的孵育時間應適當延長。

     

    檢測前準備工作: 

    1.試劑盒自冰箱中取出后應置室溫(25~28℃)平衡20分鐘;每次檢測后剩余試劑請及時于2~8℃保存。

    2.將濃縮洗滌液用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加19份水)。

    3.如有5X準品稀釋液,請按所需量用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加4水)。

    4.標準品: 按標簽復溶體積加入標準品稀釋液復溶使MCP-1終濃度達到2000pg/ml,室溫反應,請嚴格控制在25~28℃,靜置10~15分鐘后輕輕混懸(建議抽吸幾次)待徹底溶解,用標準品稀釋液倍比梯度稀釋后依次加入檢測孔中。(標準曲線取七個點,最高濃度為2000 pg/ml,標準品稀釋液直接加入作為0濃度.)

    圖片2.png 

    洗滌方法:

    自動洗板機或人工洗板:每孔洗滌液為300ul,注入與吸出間隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后將板倒扣著在厚吸水紙上用力拍干。

     

    實驗過程需自備的材料:

    1.不同規格的加樣槍及相應的槍頭;  

    2.酶標儀;

    3.自動洗板機;                     

    4.去離子水或雙蒸水;

     

     

    操作步驟:

    1.通過計算并確定一次性實驗所需的板條數,取出所需板條放置在框架內,暫時用不到板條請放回鋁箔袋密封,保存于4℃。

    2.建議設置本底較正孔,即空白孔,設置方法為該孔只加TMB顯色液和中止液。每次實驗均需做標準品對照并畫出標準曲線

    3.分別將標本或不同濃度標準品(100ul/孔)加入相應孔中,用封板膠紙封住反應孔,室溫(25~28℃)孵育120分鐘。對于血清或血漿標本,請加入50 ul樣本分析緩沖液后加50 ul標本,如稀釋量大,請將樣本與樣本分析緩沖液等量加入,不足部分用標準品稀釋液補充至100ul。   

    4.洗板5次,且最后一次置厚吸水紙上拍干。

    5.加入生物素化抗體工作液(100ul/)。用封板膠紙封住反應孔,室溫(25~28℃)孵育60分鐘。   

    6.洗板5次,且最后一次置厚吸水紙上拍干。

    7.加入親和素連接的HRP酶工作液(100ul/)。用封板膠紙封住反應孔,避光室溫(25~28℃)孵育20分鐘。

    8.洗板5次,且最后一次置厚吸水紙上拍干。

    9.加入顯色劑TMB100ul/孔,避光室溫(25~28℃)孵育20分鐘。

    10.加入終止液50ul/孔,混勻后即刻測量OD450值。

     

    結果判斷:

    1.復孔的值在20%的差異范圍內結果才有效,復孔的值平均后可作為測量值。

    2.每個標準品或標本的OD值應減去本底校正孔的OD值。

    3.手工繪制標準曲線。以標準品濃度作橫坐標,OD值作縱坐標,以平滑線連接各標準品的坐標點。通過標本的OD值可在標準曲線上查出其濃度。

    4.若標本OD值高于標準曲線上限,應適當稀釋后重測,計算濃度時應乘以稀釋倍數。

    典型數值和參考曲線

    濃度pg/ml

    典型OD值1

    典型OD值2

    OD平均值

    0

    0.0982

    0.0636

    0.0809

    62.5

    0.2421

    0.1809

    0.2115

    125

    0.3854

    0.3652

    0.3753

    250

    0.6032

    0.572

    0.5876

    500

    0.8904

    0.8174

    0.8539

    1000

    1.4387

    1.4179

    1.4283

    2000

    2.4172

    2.3732

    2.3952

    小鼠MCP-1參考標準曲線

    圖片1.png 

    注意:本圖僅供參考,應以同次試驗標準品所繪標準曲線計算標本含量。

     

    靈敏度,特異性和重復性:

    1.靈敏度:多次重復結果表明,最小檢出量為16.2pg/ml。

    2.特異性:與小鼠MCP-2、 MCP-3、 MCP-4,人MCP-1、 MCP-5、MARC等沒有交叉反應。

    3.重復性:板內,板間變異系數均<10%.

     

    參考文獻:

    Jiang, Y. et al. (1992) J. Immunol. 148:2423.

    Dunzendorfer, S. et al. (2001) J. Allergy Clin. Immunol. 108:581.

    Loetscher, P. et al. (1996) J. Immunol. 156:322.

    Kitamura, M. (1997) J. Immunol. 159:1404.

    Loghmani, F. et al. (2002) Inflammation 26:73.

    Tsuboi, N. et al. (2002) J. Immunol. 169:2026.

    Seitz, M. et al. (1995) Eur. J. Immunol. 25:1129.


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