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    小鼠白細胞介素18ELISA試劑盒Mouse IL-18 ELISA KIT
    貨號:HM-022
    價格:¥3400.00/2120.00.00
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    小鼠IL-18定量分析酶聯免疫

    檢測試劑盒

    本試劑盒僅供科研使用。用于體外定量檢測小鼠血清、血漿或細胞培養上清液中的IL-1O濃度。使用前請仔細閱讀說明書并檢查試劑組分是否完整。如有產品包裝破損或質量投拆,請在收到貨一個月之內聯系我們。

     

    IL-18簡介:

    白介18(IL-18)是一個18 kDa的細胞因子,結構上與IL-1極其相似,對T細胞的活化有重要影響。IL-18的前體缺少信號肽,前體由IL-1beta轉換酶(ICE)裂解為成熟的IL-18。

    有報道稱IL-18由下列細胞產生:樹突狀細胞、活化的巨噬細胞、凱夫勒細胞、角化細胞、腸內皮細胞、格根包爾氏細胞、腎上腺皮質細胞等。其中有報道稱人的角化細胞是IL-18的主要產生源。

    IL-18對T輔助細胞起作用,其效果是與IL-12協同強烈刺激T輔助細胞產生IFN-γ。當然,IL-18也有許多其它的效用,包括刺激外周血中由單核細胞產生IFN-γ  GM-CSF水平的升高,刺激T細胞產生Th1類的細胞因子如IL-2、IFN-γ GM-CSF等,提高Th1類的細胞表面的Fas配體的表達。此外,在治療腫瘤、感染和自身免疫方面,IL-18也是一個重要的預后指標。

     

    檢測原理:

    本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法檢測樣本中IL-18的濃度。IL-18捕獲抗體已預包被于酶標板上,當加入標本或參考品時,其中的IL-18會與捕獲抗體結合,其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。當加入辣根過氧化物酶標記的抗小鼠IL-18抗體后,抗小鼠IL-18抗體與小鼠IL-18接合,形成夾心的免疫復合物,其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。最后加入顯色劑,若樣本中存在小鼠IL-18蛋白將會形成免疫復合物,辣根過氧化物酶會催化無色的顯色劑氧化成藍色物質,在加入終止液后呈黃色。通過酶標儀檢測,讀其450nm處的OD值,小鼠IL-18濃度與OD450值之間呈正比,通過參考品繪制標準曲線,對照未知樣本中OD值,即可算出標本中小鼠IL-18濃度。

     

    小鼠IL-18定量分析酶聯免疫檢測試劑盒組成:

    組分

    規格(96T/48T)

    小鼠IL-18預包被板

    12條/6

    5×標準品稀釋液

    20ml/10ml

    小鼠IL-18標準品

    2支/1支(凍干)*

    抗體HRP結合物

    10ml/5ml

    20×濃縮洗滌液 

    30ml/15ml

    TMB底物

    10ml/5ml

    中止液

    5ml/3ml

    封板膠紙

    3/2

    說明書

    1

    標本收集:

    1.標本的收集請按下列流程進行操作;

    A.細胞上清標本離心去除懸浮物后即可;

    B.血清標本應是自然凝固后,取上清,避免在冰箱中凝固血液;

    C.血漿標本,推薦用EDTA的方法收集若待測樣本不能及時檢測,

    D.標本收集后請分裝,凍存于-20℃,避免反復凍融。

    2.血清標本不應添加任何防腐劑或抗凝劑;

    3.標本應清澈透明,檢測前樣本中如有懸浮物應通過離心去除。

    4.請勿使用溶血,高血脂或污染的標本檢測,否則結果將不準確。

    :樣本如需稀釋請用標準品稀釋液稀釋后再檢測。

    注意事項:

    1.試劑盒請保存在28℃。

    2.濃縮洗滌液因在低溫下可能有結晶,請水浴加熱使結晶完全溶解后再配制工作液。

    3.標準品復溶加樣后,剩余部份請丟棄。

    4.底物請勿接觸氧化劑和金屬。

    5.加樣時,請及時更換槍頭,避免交叉污染。

    6.嚴禁混用不同批號的試劑盒組份。

    7.充分混勻對保證反應結果的準性很重要,在加液后請輕輕叩擊邊緣以保證混勻。

    8.室溫反應,請嚴格控制在2528℃。

    9.洗滌過程是至關重要的,洗滌不充分會使精確度下降并導致結果誤差較大。

    10.試驗中標準品和樣本檢測時建議作雙復孔。

    11.加樣過程中避免氣泡的產生。

     

    樣本的稀釋:

    1. 血清或血漿樣本5~30倍稀釋,不同樣本含量不一樣,檢測前需預實驗,如無明確范圍,可從5倍開始。

    2.細胞上清及尿樣本稀釋倍數根據預實驗確定;

     

    檢測前準備工作: 

    1.試劑盒自冰箱中取出后應置室溫(2528℃)平衡20分鐘;每次檢測后剩余試劑請及時于28℃保存。

    2.將濃縮洗滌液用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加19份水)。

    3.5×標準品稀釋液用去離子水或雙蒸水按1:4稀釋成所需的體積;

    4.將檢測抗體用檢測抗體稀釋液按標識提前10分鐘配制成工作濃度;

    5.標準品: 按標簽復溶體積加入標準品稀釋液復溶使IL-18終濃度達到1500pg/ml,室溫反應,請嚴格控制在2528℃,靜置10~15分鐘后輕輕混懸(建議抽吸幾次)待徹底溶解,用標準品稀釋液倍比梯度稀釋后依次加入檢測孔中。(標準曲線取七個點,最高濃度為100ng/ml,標準品稀釋液直接加入作為0濃度.)下圖為標準品稀釋示意圖。

    圖片2.png 

    洗滌方法:

    自動洗板機或小鼠工洗板:每孔洗滌液為300ul,注入與吸出間隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后將板倒扣著在厚吸水紙上用力拍干。

     

    實驗過程需自備的材料:

    1.不同規格的加樣槍及相應的槍頭;   

    2.酶標儀;

    3.自動洗板機;                     

    4.去離子水或雙蒸水;

     

    操作步驟:

    1.通過計算并確定一次性實驗所需的板條數,取出所需板條放置在框架內,暫時用不到板條請放回鋁箔袋密封,保存于4℃。

    2.建議設置本底較正孔,即空白孔,設置方法為該孔只加TMB顯色液和中止液。每次實驗均需做標準品對照并畫出標準曲線。

    3.分別將稀釋好的標本或不同濃度標準品(100ul/孔)加入相應孔中,用封板膠紙封住反應孔,室溫(25~28℃)孵育120分鐘。    

    4.洗板3次(重要提示,一定是三次),且最后一次置厚吸水紙上拍干。

    5.每孔加入HRP抗體結合物工作液(100ul/)。用封板膠紙封住反應孔,室溫(25~28℃)孵育60分鐘。    

    6.洗板3次(重要提示,一定是三次),且最后一次置厚吸水紙上拍干。

    7. 加入顯色劑TMB100ul/孔,避光室溫(25~28℃)孵育20分鐘。

    8. 加入終止液50ul/孔,混勻后即刻測量OD450值。

    結果判斷:

    1.復孔的值在20%的差異范圍內結果才有效,復孔的值平均后可作為測量值。

    2.每個標準品或標本的OD值應減去本底校正孔的OD值。

    3.手工繪制標準曲線。以標準品濃度作橫坐標,OD值作縱坐標,以平滑線連接各標準品的坐標點。通過標本的OD值可在標準曲線上查出其濃度。

    4.若標本OD值高于標準曲線上限,應適當稀釋后重測,計算濃度時應乘以稀釋倍數

    典型數值和參考曲線

    濃度ng/ml

    典型OD1

    典型OD2

    OD平均值

    0

    0.076

    0.086

    0.081

    46.875

    0.134

    0.218

    0.176

    93.75

    0.213

    0.339

    0.276

    187.5

    0.412

    0.55

    0.481

    375

    0.811

    1.015

    0.913

    750

    1.46

    1.62

    1.54

    1500

    2.603

    2.909

    2.756

    小鼠IL-18參考標準曲線

    1.png 

    注意:本圖僅供參考,應以同次試驗標準品所繪標準曲線計算標本含量

     

    靈敏度,特異性和重復性:

    1.靈敏度:多次重復結果表明,最小檢出量為16.8ng/ml。

    2.特異性:與小鼠的IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12 p70, IL-13, IL-17及人IL-18等沒有交叉反應。

    3.重復性:板內,板間變異系數均<10%.

     

    參考文獻:

    1. Lalor, S.J. et al. (2011) J. Immunol. 186:5738.

    2. Gu, Y. et al. (1997) Science 275:206.

    3. Fehniger, T.A. et al. (1999) J. Immunol. 162:4511.

    4. Smith, D.E. (2011) J. Leukoc. Biol. 89:383.

    5. Elbim, C. et al. (2005) Clin. Diagn. Lab. Immunol. 12:436.

    6. Yoshimoto, T. et al. (2000) Nat. Immunol. 1:132.

    7. Kroeger, K.M. et al. (2009) J. Leukoc. Biol. 86:769.


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