人的可溶性細胞分化抗原14定量分析酶聯免疫檢測試劑盒

本試劑盒僅供科研使用。用于體外定量檢測人血清、血漿或細胞培養上清液中的CD14濃度。使用前請仔細閱讀說明書并檢查試劑組分是否完整。如有產品包裝破損或質量投拆，請在收到貨一個月之內聯系我們。

人CD14簡介：

作為免疫系統的一種成分，CD14是單核/粒細胞分化抗原中一種糖蛋白，由單核細胞、巨噬細胞及活化的中性粒細胞產生。人的CD14的基因編碼375個氨基酸，包括19個氨基酸的信號肽和C末端疏水結構域，其作用為與糖基磷脂酰肌醇結合形成錨蛋白。CD14有兩種存在形式，包括55 KDa的具錨蛋白尾巴膜蛋白（mCD!4）和48 KDa存在于血清和體液中可溶性的CD14（sCD!4）。

CD14是一種與脂多糖（LPS）結合的模式受體蛋白，也與不同細菌表面的成分的配基結合，包括作為Toll樣受體4的配位受體、MD-2的配位受體。CD14可能還介導轉移其它的各種脂類，介導不同免疫應答過程中細胞間的連系以及介導調亡細胞的識別等有關生理活動。

檢測原理:

本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法檢測樣本中CD14的濃度。CD14捕獲抗體已預包被于酶標板上，當加入標本或參考品時，其中的CD14 會與捕獲抗體結合，其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。當加入生物素化的抗人CD14 抗體后，抗人CD14 抗體與CD14 接合，形成夾心的免疫復合物，其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。隨后加入辣根過氧化物酶標記的親合素。生物素與親合素特異性結合，親合素連接的酶就會與夾心的免疫復合物連接起來；其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。最后加入顯色劑，若樣本中存在CD14 將會形成免疫復合物，辣根過氧化物酶會催化無色的顯色劑氧化成藍色物質，在加入終止液后呈黃色。通過酶標儀檢測，讀其450nm處的OD值，CD14 濃度與OD₄₅₀值之間呈正比，通過參考品繪制標準曲線，對照未知樣本中OD值，即可算出標本中CD14 濃度。

人CD14定量分析酶聯免疫檢測試劑盒組成:

標本收集:

1.標本的收集請按下列流程進行操作；

A.細胞上清標本離心去除懸浮物后即可；

B.血清標本應是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液；

C.血漿標本，推薦用EDTA的方法收集；

D.若待測樣本不能及時檢測，標本收集后請分裝，凍存于－20℃，避免反復凍融。

2.血清標本不應添加任何防腐劑或抗凝劑；

3.標本應清澈透明，檢測前樣本中如有懸浮物應通過離心去除。

4.請勿使用溶血，高血脂或污染的標本檢測，否則結果將不準確。

注：人血清或血漿樣本請用標準品稀釋液稀釋后再檢測。

注意事項:

1.試劑盒請保存在2～8℃。

2.濃縮洗滌液因在低溫下可能有結晶，請水浴加熱使結晶完全溶解后再配制工作液。

3.標準品復溶加樣后，剩余部份請丟棄。

4.底物請勿接觸氧化劑和金屬。

5.加樣時，請及時更換槍頭，避免交叉污染。

6.嚴禁混用不同批號的試劑盒組份。

7.充分混勻對保證反應結果的準性很重要，在加液后請輕輕叩擊邊緣以保證混勻。

8.室溫反應，請嚴格控制在25～28℃。

9.洗滌過程是至關重要的，洗滌不充分會使精確度下降并導致結果誤差較大。

10.試驗中標準品和樣本檢測時建議作雙復孔。

11.加樣過程中避免氣泡的產生。

12.血清和血漿標本的檢測時，檢測抗體的孵育時間應適當延長。

檢測前準備工作:

1.試劑盒自冰箱中取出后應置室溫（25～28℃）平衡20分鐘；每次檢測后剩余試劑請及時于2～8℃保存。

2.將濃縮洗滌液用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加19份水)。

3.如有5X準品稀釋液，請按所需量用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加4水)。

4.標準品: 按標簽復溶體積加入1X標準品稀釋液復溶使CD14終濃度達到4000pg/ml，室溫反應，請嚴格控制在25～28℃，靜置15~20分鐘后輕輕混懸（建議抽吸幾次）待徹底溶解，用標準品稀釋液倍比梯度稀釋后依次加入檢測孔中。（標準曲線取七個點，最高濃度為4000 pg/ml,標準品稀釋液直接加入作為0濃度.）

5．檢測抗體，加樣前，按1：100配制所需的工作液。

洗滌方法:

自動洗板機或人工洗板：每孔洗滌液為300μl，注入與吸出間隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后將板倒扣著在厚吸水紙上用力拍干。

實驗過程需自備的材料：

1.不同規格的加樣槍及相應的槍頭；   

2.酶標儀；

3.自動洗板機；                    

4.去離子水或雙蒸水；

操作步驟:

1.通過計算并確定一次性實驗所需的板條數，取出所需板條放置在框架內，暫時用不到板條請放回鋁箔袋密封，保存于4℃。

2.建議設置本底較正孔，即空白孔,設置方法為該孔只加TMB顯色液和中止液。每次實驗均需做標準品對照并畫出標準曲線。

3.分別將標本或不同濃度標準品(100ul/孔)加入相應孔中，用封板膠紙封住反應孔，室溫（25～28℃）孵育120分鐘。如果是血清血漿樣本，不同樣本稀釋比例不一樣，一般范圍在300~30000倍，細胞上清稀釋5倍。如無明確范圍，建議從500倍開始，加樣稀釋說明如下：每孔先加樣本分析緩沖液50ul，再加用1×標準品稀釋液稀釋250倍后的樣本，加樣量為50ul。

4.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

5.加入生物素化抗體工作液(100ul/孔)。用封板膠紙封住反應孔，室溫（25～28℃）孵育60分鐘。   

6.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

7.加入親和素連接的HRP酶工作液(100ul/孔)。用封板膠紙封住反應孔，避光室溫（25～28℃）孵育20分鐘。

8.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

9.加入顯色劑TMB100ul/孔，避光室溫（25～28℃）孵育20分鐘。

10.加入終止液50ul/孔,混勻后即刻測量OD450值。

結果判斷:

1.復孔的值在20%的差異范圍內結果才有效，復孔的值平均后可作為測量值。

2.每個標準品或標本的OD值應減去本底校正孔的OD值。

3.手工繪制標準曲線。以標準品濃度作橫坐標，OD值作縱坐標，以平滑線連接各標準品的坐標點。通過標本的OD值可在標準曲線上查出其濃度。

4.若標本OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測，計算濃度時應乘以稀釋倍數。

典型數值和參考曲線

人CD14參考標準曲線

注意：本圖僅供參考，應以同次試驗標準品所繪標準曲線計算標本含量。

靈敏度，特異性和重復性:

1.靈敏度：多次重復結果表明，最小檢出量為29pg/ml。

2.特異性：與人的GM-CSF 、IL-4、TNF-α及小鼠的CD14、 IL-13無交叉反應性。

3.重復性：板內，板間變異系數均<10%.

參考文獻:

1. Bazil, V. et al. (1989) Mol. Immunol. 26:657.

2. Ferrero, E. et al. (1998) J. Immunol. 160:2675.

3. Ulevitch, R.J. and P.S. Tobias (1995) Annu. Rev. Immunol. 13:437.

4. Frey, E.A. et al. (1992) J. Exp. Med. 176:1655.

5. Bazil, V. et al. (1986) Eur. J. Immunol. 16:1583.

6. Simmons, D.L. et al. (1989) Blood 73:284.