人熱休克蛋白70定量分析酶聯免疫檢測試劑盒

本試劑盒僅供科研使用。用于體外定量檢測人血清、血漿中的熱休克蛋白70原濃度。使用前請仔細閱讀說明書并檢查試劑組分是否完整。如有產品包裝破損或質量投拆，請在收到貨一個月之內聯系我們。

熱休克蛋白70原簡介：

熱休克蛋白70（HSP70），也叫做熱休克蛋白1A (HSPA1A)。是一個屬于保護性熱休克蛋白70家族的一員，分子量約70千道爾頓。HSP70在各類細胞中都是豐富表達的保守蛋白。HSP70蛋白的N端具有核苷酸結合且具ATP酶活性的結構，C端底物結合結構域。人的HSP70與小鼠和大鼠的蛋白序列分別有95%和97%的同源性。

Hsp70的核苷酸及底物結合結構協同起作用達到保護新生蛋白正確折疊，幫助折疊錯誤的蛋白或無功能重新正確折疊成有功能的蛋白。HSP70能協助蛋白通過細胞膜，阻止蛋白的過度聚集，能協助過氧化物酶對錯誤的蛋白進行降解。在病理學方面，許多種的腫瘤中都觀察到HSP70的增加。在一些神經組退化的病癥中，也因協助錯誤折疊蛋白的再折疊而引起HSP70的積累，而觀察到HSP70的大量升高。

檢測原理:

本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法檢測樣本中熱休克蛋白70的濃度。熱休克蛋白70捕獲抗體已預包被于酶標板上，當加入標本或參考品時，其中的熱休克蛋白70會與捕獲抗體結合，其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。當加入辣根過氧化物酶標記的抗人熱休克蛋白70抗體后，抗人熱休克蛋白70抗體與熱休克蛋白70接合，形成夾心的免疫復合物，其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。最后加入顯色劑，若樣本中存在熱休克蛋白70將會形成免疫復合物，辣根過氧化物酶會催化無色的顯色劑氧化成藍色物質，在加入終止液后呈黃色。通過酶標儀檢測，讀其450nm處的OD值，熱休克蛋白70濃度與OD₄₅₀值之間呈正比，通過參考品繪制標準曲線，對照未知樣本中OD值，即可算出標本中熱休克蛋白70濃度。

人熱休克蛋白70定量分析酶聯免疫檢測試劑盒組成:

標本收集:

1.標本的收集請按下列流程進行操作；

A.細胞上清標本離心去除懸浮物后即可；

B.血清標本應是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液；

C.血漿標本，推薦用EDTA的方法收集若待測樣本不能及時檢測，

D.標本收集后請分裝，凍存于－20℃，避免反復凍融。

2.血清標本不應添加任何防腐劑或抗凝劑；

3.標本應清澈透明，檢測前樣本中如有懸浮物應通過離心去除。

4.請勿使用溶血，高血脂或污染的標本檢測，否則結果將不準確。

注意事項:

1.試劑盒請保存在2～8℃。

2.濃縮洗滌液因在低溫下可能有結晶，請水浴加熱使結晶完全溶解后再配制工作液。

3.標準品復溶加樣后，剩余部份請丟棄。

4.底物請勿接觸氧化劑和金屬。

5.加樣時，請及時更換槍頭，避免交叉污染。

6.嚴禁混用不同批號的試劑盒組份。

7.充分混勻對保證反應結果的準性很重要，在加液后請輕輕叩擊邊緣以保證混勻。

8.室溫反應，請嚴格控制在25～28℃。

9.洗滌過程是至關重要的，洗滌不充分會使精確度下降并導致結果誤差較大。

10.試驗中標準品和樣本檢測時建議作雙復孔。

11.加樣過程中避免氣泡的產生。

檢測前準備工作: 

1.試劑盒自冰箱中取出后應置室溫（25～28℃）平衡20分鐘；每次檢測后剩余試劑請及時于2～8℃保存。

2.將濃縮洗滌液用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加19份水)。

3. 將檢測抗體用檢測抗體稀釋液按標識提前10分鐘配制成工作濃度；

3.如有5X準品稀釋液，請按所需量用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加4水)。

4.標準品: 按標簽復溶體積加入標準品稀釋液復溶使熱休克蛋白70終濃度達到1000ng/ml，室溫反應，請嚴格控制在25～28℃，靜置10~15分鐘后輕輕混懸（建議抽吸幾次）待徹底溶解，用標準品稀釋液倍比梯度稀釋后依次加入檢測孔中。（標準曲線取七個點，最高濃度為1000ng/ml,標準品稀釋液直接加入作為0濃度.）下圖為標準品稀釋示意圖。

洗滌方法:

自動洗板機或人工洗板：每孔洗滌液為300ul，注入與吸出間隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后將板倒扣著在厚吸水紙上用力拍干。

實驗過程需自備的材料：

1.不同規格的加樣槍及相應的槍頭；   

2.酶標儀；

3.自動洗板機；                     

4.去離子水或雙蒸水；

操作步驟:

1.通過計算并確定一次性實驗所需的板條數，取出所需板條放置在框架內，暫時用不到板條請放回鋁箔袋密封，保存于4℃。

2.建議設置本底較正孔，即空白孔,設置方法為該孔只加TMB顯色液和中止液。每次實驗均需做標準品對照并畫出標準曲線。

3.分別將稀釋好的標本或不同濃度標準品(100ul/孔)加入相應孔中，用封板膠紙封住反應孔，37℃孵育120分鐘。    

4.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

5.每孔加入HRP抗體結合物工作液(100ul/孔)。用封板膠紙封住反應孔，37℃孵育孵育60分鐘。    

6.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

7. 加入顯色劑TMB100ul/孔，避光室溫（25～28℃）孵育20分鐘。

8. 加入終止液50ul/孔,混勻后即刻測量OD₄₅₀值。

結果判斷:

1.復孔的值在20%的差異范圍內結果才有效，復孔的值平均后可作為測量值。

2.每個標準品或標本的OD值應減去本底校正孔的OD值。

3.手工繪制標準曲線。以標準品濃度作橫坐標，OD值作縱坐標，以平滑線連接各標準品的坐標點。通過標本的OD值可在標準曲線上查出其濃度。

4.若標本OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測，計算濃度時應乘以稀釋倍數

典型數值和參考曲線

人熱休克蛋白70參考標準曲線

注意：本圖僅供參考，應以同次試驗標準品所繪標準曲線計算標本含量。

靈敏度，特異性和重復性:

1.靈敏度：多次重復結果表明，最小檢出量為7.2ng/ml。

2.特異性：與人的GRP-78、HSPA2、HSPA6、HSPA8等沒有交叉反應。

3.重復性：板內，板間變異系數均<10%.

參考文獻:

1. Gaudio, E. et al. (2013) Blood 121:351.

2. Liu, M. et al. (2008) J. Biol. Chem. 283:35783.

3. Cho, H.S. et al. (2012) Nat. Commun. 3:1072.

4. Wang, A.M. et al. (2013) Nat. Chem. Biol. 9:112.

5. Wu, F.H. et al. (2012) Cancer Lett. 317:157.

6. McDonough, H. & C. Patterson (2003) Cell Stress Chaperones 8:303.