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    人的熱休克蛋白70ELISA試劑盒Human HSP70 ELISA KIT
    貨號:HH-124
    價格:¥4200.00/2600.00.00
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    人熱休克蛋白70定量分析酶聯免疫檢測試劑盒

     

    本試劑盒僅供科研使用。用于體外定量檢測人血清、血漿中的熱休克蛋白70原濃度。使用前請仔細閱讀說明書并檢查試劑組分是否完整。如有產品包裝破損或質量投拆,請在收到貨一個月之內聯系我們。

     

    熱休克蛋白70原簡介:

    熱休克蛋白70(HSP70),也叫做熱休克蛋白1A (HSPA1A)。是一個屬于保護性熱休克蛋白70家族的一員,分子量約70千道爾頓。HSP70在各類細胞中都是豐富表達的保守蛋白。HSP70蛋白的N端具有核苷酸結合且具ATP酶活性的結構,C端底物結合結構域。人的HSP70與小鼠和大鼠的蛋白序列分別有95%和97%的同源性。

    Hsp70的核苷酸及底物結合結構協同起作用達到保護新生蛋白正確折疊,幫助折疊錯誤的蛋白或無功能重新正確折疊成有功能的蛋白。HSP70能協助蛋白通過細胞膜,阻止蛋白的過度聚集,能協助過氧化物酶對錯誤的蛋白進行降解。在病理學方面,許多種的腫瘤中都觀察到HSP70的增加。在一些神經組退化的病癥中,也因協助錯誤折疊蛋白的再折疊而引起HSP70的積累,而觀察到HSP70的大量升高。

     

    檢測原理:

    本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法檢測樣本中熱休克蛋白70的濃度。熱休克蛋白70捕獲抗體已預包被于酶標板上,當加入標本或參考品時,其中的熱休克蛋白70會與捕獲抗體結合,其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。當加入辣根過氧化物酶標記的抗人熱休克蛋白70抗體后,抗人熱休克蛋白70抗體與熱休克蛋白70接合,形成夾心的免疫復合物,其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。最后加入顯色劑,若樣本中存在熱休克蛋白70將會形成免疫復合物,辣根過氧化物酶會催化無色的顯色劑氧化成藍色物質,在加入終止液后呈黃色。通過酶標儀檢測,讀其450nm處的OD值,熱休克蛋白70濃度與OD450值之間呈正比,通過參考品繪制標準曲線,對照未知樣本中OD值,即可算出標本中熱休克蛋白70濃度。

    人熱休克蛋白70定量分析酶聯免疫檢測試劑盒組成:

    組分

    規格(96T/48T)

    人熱休克蛋白70預包被板

    12條/6

    標準品稀釋液

    10ml/5ml

    人熱休克蛋白70標準品

    2支/1支(凍干)*

    抗體HRP結合物

    10ml/5ml

    濃縮洗滌液 20×

    30ml/15ml

    TMB底物

    10ml/5ml

    中止液

    5ml/3ml

    封板膠紙

    3/2

    說明書

    1

     

    標本收集:

    1.標本的收集請按下列流程進行操作;

    A.細胞上清標本離心去除懸浮物后即可;

    B.血清標本應是自然凝固后,取上清,避免在冰箱中凝固血液;

    C.血漿標本,推薦用EDTA的方法收集若待測樣本不能及時檢測,

    D.標本收集后請分裝,凍存于-20℃,避免反復凍融。

    2.血清標本不應添加任何防腐劑或抗凝劑;

    3.標本應清澈透明,檢測前樣本中如有懸浮物應通過離心去除。

    4.請勿使用溶血,高血脂或污染的標本檢測,否則結果將不準確。

     

    注意事項:

    1.試劑盒請保存在28℃。

    2.濃縮洗滌液因在低溫下可能有結晶,請水浴加熱使結晶完全溶解后再配制工作液。

    3.標準品復溶加樣后,剩余部份請丟棄。

    4.底物請勿接觸氧化劑和金屬。

    5.加樣時,請及時更換槍頭,避免交叉污染。

    6.嚴禁混用不同批號的試劑盒組份。

    7.充分混勻對保證反應結果的準性很重要,在加液后請輕輕叩擊邊緣以保證混勻。

    8.室溫反應,請嚴格控制在25~28℃。

    9.洗滌過程是至關重要的,洗滌不充分會使精確度下降并導致結果誤差較大。

    10.試驗中標準品和樣本檢測時建議作雙復孔。

    11.加樣過程中避免氣泡的產生。

     

    檢測前準備工作: 

    1.試劑盒自冰箱中取出后應置室溫(25~28℃)平衡20分鐘;每次檢測后剩余試劑請及時于2~8℃保存。

    2.將濃縮洗滌液用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加19份水)。

    3. 將檢測抗體用檢測抗體稀釋液按標識提前10分鐘配制成工作濃度;

    3.如有5X準品稀釋液,請按所需量用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加4水)。

    4.標準品: 按標簽復溶體積加入標準品稀釋液復溶使熱休克蛋白70終濃度達到1000ng/ml,室溫反應,請嚴格控制在25~28℃,靜置10~15分鐘后輕輕混懸(建議抽吸幾次)待徹底溶解,用標準品稀釋液倍比梯度稀釋后依次加入檢測孔中。(標準曲線取七個點,最高濃度為1000ng/ml,標準品稀釋液直接加入作為0濃度.)下圖為標準品稀釋示意圖。

    圖片2.png 

    洗滌方法:

    自動洗板機或人工洗板:每孔洗滌液為300ul,注入與吸出間隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后將板倒扣著在厚吸水紙上用力拍干。

     

    實驗過程需自備的材料:

    1.不同規格的加樣槍及相應的槍頭;   

    2.酶標儀;

    3.自動洗板機;                     

    4.去離子水或雙蒸水;

     

    操作步驟:

    1.通過計算并確定一次性實驗所需的板條數,取出所需板條放置在框架內,暫時用不到板條請放回鋁箔袋密封,保存于4℃。

    2.建議設置本底較正孔,即空白孔,設置方法為該孔只加TMB顯色液和中止液。每次實驗均需做標準品對照并畫出標準曲線。

    3.分別將稀釋好的標本或不同濃度標準品(100ul/孔)加入相應孔中,用封板膠紙封住反應孔,37℃孵育120分鐘。    

    4.洗板5次,且最后一次置厚吸水紙上拍干。

    5.每孔加入HRP抗體結合物工作液(100ul/)。用封板膠紙封住反應孔,37℃孵育孵育60分鐘。    

    6.洗板5次,且最后一次置厚吸水紙上拍干。

    7. 加入顯色劑TMB100ul/孔,避光室溫(25~28℃)孵育20分鐘。

    8. 加入終止液50ul/孔,混勻后即刻測量OD450值。

     

    結果判斷:

    1.復孔的值在20%的差異范圍內結果才有效,復孔的值平均后可作為測量值。

    2.每個標準品或標本的OD值應減去本底校正孔的OD值。

    3.手工繪制標準曲線。以標準品濃度作橫坐標,OD值作縱坐標,以平滑線連接各標準品的坐標點。通過標本的OD值可在標準曲線上查出其濃度。

    4.若標本OD值高于標準曲線上限,應適當稀釋后重測,計算濃度時應乘以稀釋倍數

    典型數值和參考曲線

    濃度ng/ml

    典型OD1

    典型OD2

    OD平均值

    0

    0.094

    0.07

    0.082

    15.625

    0.211

    0.151

    0.181

    31.25

    0.379

    0.335

    0.357

    62.5

    0.584

    0.5

    0.542

    125

    0.836

    0.756

    0.796

    250

    1.152

    1.024

    1.088

    500

    1.435

    1.345

    1.39

    1000

    1.857

    1.665

    1.761

    人熱休克蛋白70參考標準曲線

    圖片1.png 

     

    注意:本圖僅供參考,應以同次試驗標準品所繪標準曲線計算標本含量。

     

    靈敏度,特異性和重復性:

    1.靈敏度:多次重復結果表明,最小檢出量為7.2ng/ml。

    2.特異性:與人的GRP-78、HSPA2、HSPA6、HSPA8等沒有交叉反應。

    3.重復性:板內,板間變異系數均<10%.

     

    參考文獻:

    1. Gaudio, E. et al. (2013) Blood 121:351.

    2. Liu, M. et al. (2008) J. Biol. Chem. 283:35783.

    3. Cho, H.S. et al. (2012) Nat. Commun. 3:1072.

    4. Wang, A.M. et al. (2013) Nat. Chem. Biol. 9:112.

    5. Wu, F.H. et al. (2012) Cancer Lett. 317:157.

    6. McDonough, H. & C. Patterson (2003) Cell Stress Chaperones 8:303.

     


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