豬白細胞介素6定量分析酶聯免疫檢測試劑盒

本試劑盒僅供科研使用。用于體外定量檢測豬血清、血漿或細胞培養上清液中的IL-6濃度。使用前請仔細閱讀說明書并檢查試劑組分是否完整, 如有產品包裝破損或質量投拆，請在收到貨一個月之內聯系我們。

豬IL-6簡介：

白介素6（IL-6）是一類多功能的蛋白，在宿主防御，急性期反應，免疫反應，造血功能，神經系統等方面起到重要的作用。白介素6根據來源不同是分子量從21到28kDa不同的單鏈蛋白。白介素6在多種細胞中都有表達，如T細胞、巨噬細胞、纖維原細胞、肝細胞、血管內皮細胞等。由于IL-6具有不同的活性，所以IL-6也被稱為干擾素β2(IFN-β2)、B細胞刺激因子-2(BSF-2)、雜交瘤細胞生長因子、肝細胞刺激因子、毒性T細胞分化因子、巨噬細胞粒細胞誘導因子(MGI-2A)。白細胞介素6在B-細胞向Ig分泌細胞的轉化過程起到重要的作用，參與了淋巴細胞和單核細胞的分化，誘導神經細胞在B-細胞，T-細胞，肝細胞，造血干細胞以及中樞神經系統的分化作用。此外，肌肉運動收縮作用后白細胞介素6會被釋放到血液中，進而能促進脂肪的分解并改善機體的胰島素耐受性。

檢測原理:

本試劑盒采用雙抗體夾心ELISA法檢測樣本中IL-6的濃度。IL-6捕獲抗體已預包被于酶標板上，當加入標本或參考品時，其中的IL-6會與捕獲抗體結合，其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。當加入生物素化的抗豬IL-6抗體后，抗豬IL-6抗體與IL-6接合，形成夾心的免疫復合物，其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。隨后加入辣根過氧化物酶標記的親合素。生物素與親合素特異性結合，親合素連接的酶就會與夾心的免疫復合物連接起來；其它游離的成分通過洗滌的過程被除去。最后加入顯色劑，若樣本中存在IL-6將會形成免疫復合物，辣根過氧化物酶會催化無色的顯色劑氧化成藍色物質，在加入終止液后呈黃色。通過酶標儀檢測，讀其450nm處的OD值，IL-6濃度與OD₄₅₀值之間呈正比，通過參考品繪制標準曲線，對照未知樣本中OD值，即可算出標本中IL-6濃度。

豬IL-6定量分析酶聯免疫檢測試劑盒組成:

標本收集:

1.標本的收集請按下列流程進行操作；

A.細胞上清標本離心去除懸浮物后即可；

B.血清標本應是自然凝固后，取上清，避免在冰箱中凝固血液；

C.血漿標本，推薦用EDTA的方法收集；

D.若待測樣本不能及時檢測，標本收集后請分裝，凍存于－20℃，避免反復凍融。

2.血清標本不應添加任何防腐劑或抗凝劑；

3.標本應清澈透明，檢測前樣本中如有懸浮物應通過離心去除。

4.請勿使用溶血，高血脂或污染的標本檢測，否則結果將不準確。

注：豬血清或血漿樣本請用樣本分析緩沖液做倍比稀釋后再檢測。

注意事項:

1.試劑盒請保存在2～8℃。

2.濃縮洗滌液因在低溫下可能有結晶，請水浴加熱使結晶完全溶解后再配制工作液。

3.標準品復溶加樣后，剩余部份請丟棄。

4.底物請勿接觸氧化劑和金屬。

5.加樣時，請及時更換槍頭，避免交叉污染。

6.嚴禁混用不同批號的試劑盒組份。

7.充分混勻對保證反應結果的準性很重要，在加液后請輕輕叩擊邊緣以保證混勻。

8.室溫反應，請嚴格控制在25-28℃。

9.洗滌過程是至關重要的，洗滌不充分會使精確度下降并導致結果誤差較大。

10.試驗中標準品和樣本檢測時建議作雙復孔。

11.加樣過程中避免氣泡的產生。

12.血清和血漿標本的檢測時，檢測抗體的孵育時間應適當延長

檢測前準備工作:

1.試劑盒自冰箱中取出后應置室溫（25-28℃）平衡20分鐘；每次檢測后剩余試劑請及時于2～8℃保存。

2.將濃縮洗滌液用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加19份水)。

3.如有5x標準品稀釋液，請按所需量用雙蒸水或去離子水稀釋(1份加4份水)。

4.標準品: 按標簽復溶體積加入pH8.4的1%BSA/PBS緩沖液使IL-6終濃度達到8000pg/ml，室溫反應，請嚴格控制在25～28℃，靜置10~15分鐘后輕輕混懸（建議抽吸幾次）待徹底溶解，用標準品稀釋液倍比梯度稀釋后依次加入檢測孔中。（標準曲線取七個點，最高濃度為8000 pg/ml,標準品稀釋液直接加入作為0濃度.）

洗滌方法:

自動洗板機或豬工洗板：每孔洗滌液為300ul，注入與吸出間隔15-30秒。洗板5次。最后一次洗板完成后將板倒扣著在厚吸水紙上用力拍干。

實驗過程需自備的材料：

1.不同規格的加樣槍及相應的槍頭；   

2.酶標儀；

3.自動洗板機；                     

4.去離子水或雙蒸水；

操作步驟:

1.通過計算并確定一次性實驗所需的板條數，取出所需板條放置在框架內，暫時用不到板條請放回鋁箔袋密封，保存于4℃。

2.建議設置本底較正孔，即空白孔,設置方法為該孔只加TMB顯色液和中止液。每次實驗均需做標準品對照并畫出標準曲線。

3.分別將標本或不同濃度標準品(100ul/孔)加入相應孔中，用封板膠紙封住反應孔，室溫（25-28℃）孵育120分鐘。對于血清或血漿標本，請加入50 ul樣本分析緩沖液后加50 ul標本，如稀釋量大，請將樣本與樣本分析緩沖液等量加入，不足部分用標準品稀釋液補充至100ul。      

4.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

5.加入生物素化抗體工作液(100ul/孔)。用封板膠紙封住反應孔，室溫（25-28℃）孵育60分鐘。   

6.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

7.加入親和素連接的HRP酶工作液(100ul/孔)。用封板膠紙封住反應孔，避光室溫（25-28℃）孵育20分鐘。   

8.洗板5次，且最后一次置厚吸水紙上拍干。

9.加入顯色劑TMB100ul/孔，避光室溫（25-28℃）孵育20分鐘。

10.加入中止液50ul/孔,混勻后即刻測量OD450值。

結果判斷:

1.復孔的值在20%的差異范圍內結果才有效，復孔的值平均后可作為測量值。

2.每個標準品或標本的OD值應減去本底校正孔的OD值。

3.手工繪制標準曲線。以標準品濃度作橫坐標，OD值作縱坐標，以平滑線連接各標準品的坐標點。通過標本的OD值可在標準曲線上查出其濃度。

4.若標本OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測，計算濃度時應乘以稀釋倍數。

典型數值和參考曲線

豬IL-6參考標準曲線

注意：本圖僅供參考，應以同次試驗標準品所繪標準曲線計算標本含量。

靈敏度，特異性和重復性:

1.靈敏度：多次重復結果表明，最小檢出量為114pg/ml。

2.特異性：與人、小鼠、大鼠的IL－6均無交叉反應性。

3.重復性：板內，板間變異系數均<10%.

參考文獻:

1. Muller-Newen, G. (2003) Sci. STKE 2003:PE40.

2. Rose-John, S. et al. (2006) J. Leukoc. Biol. 80:227.

3. Mitsuyama, K. et al. (2006) Clin. Exp. Immunol. 143:125.

4. Hodge, D.R. et al. (2005) Eur. J. Cancer 41:2502.

5. Jung, H.C. et al. (1995) J. Clin. Invest. 95:55.

6. Jones, S.A. (2005) J. Immunol. 175:3468.

7. Bihl, M.P. et al. (2002) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 27:48.

8. Naugler, W.E. and M. Karin (2008) Trends Mol. Med. 14:109.

9. Alberti, L. et al. (2005) Cancer Res. 65:2.

10. Schuett, H. et al. (2009) Thromb. Haemost. 102:215.